Содержание
- Обнаружение с использованием изменения цвета
- Использование считывателя ELISA для измерения
- Прямой конкурентный ИФА (цитохром с)
- Инкубируйте первичное антитело в пробирках
ELISA-тест представляет собой энзим-связанный иммуносорбентный анализ, в котором используются антитела или антигены, связанные с определенным ферментом, для определения концентрации антитела или антигена. Если вы принимаете ELISA и не можете использовать специфические антитела для получения результатов, рекомендуется использовать конкурентный ELISA, потому что вместо антитела используется антиген, конъюгированный с ферментом, и другой метод обнаружения.
Обнаружение с использованием изменения цвета
Общим протоколом для конкурентного ИФА является использование немеченого и очищенного первичного антитела. Антитело покрывает лунки планшета для микротитрования и инкубируется с неизвестными стандартами. Затем добавляют иммуноген для конъюгата с первичным антителом, которое будет связываться с сайтами антител, которые еще не заняты. Субстрат затем используется для создания изменения цвета для измерения концентрации связующего.
Использование считывателя ELISA для измерения
Используйте микротитровальный полистирольный планшет и добавьте первичное антитело в каждую лунку. Для достижения максимального связывания заполните лунку одним микрограммом антитела. Инкубируйте планшет в течение четырех часов при комнатной температуре. Добавить первичное антитело захвата и промыть лунки с PBS (фосфатно-солевым буфером). Инкубируйте чашки с блокирующим буфером в течение двух часов при комнатной температуре. Дважды промойте лунки PBS и добавьте стандарты. Поместите раствор антиген-конъюгата в лунки и снова инкубируйте в течение двух часов. Вымойте пластину снова PBS четыре раза. Добавьте субстрат и измерьте плотность на определенной длине волны, используя считывающее устройство ELISA.
Прямой конкурентный ИФА (цитохром с)
Для прямого конкурентного ИФА необходимо провести анализ разведения сыворотки на антиген, который вы используете в эксперименте. Затем планшет для микротитрования покрывают цитохромом с и инкубируют в течение ночи. Затем часть анализа ELISA выполняют путем добавления блокирующего реагента и вторичного антитела. Результаты поглощения считываются с помощью микропланшет-ридера.
Инкубируйте первичное антитело в пробирках
В этой процедуре первичное антитело инкубируют в пробирках, в которых с ним связывается интересующий антиген. Образцы затем добавляют в лунки микротитровальных планшетов и инкубируют. Затем лунки промывают, чтобы удалить любые несвязанные комплексы антиген-антитело, и затем добавляют блокирующий раствор, чтобы предотвратить связывание второго антитела с лунками. Вторичное антитело затем считывают на планшет-ридере для получения результатов.