Содержание
Методы электрофореза разделяют молекулы ДНК в зависимости от их размеров; аналогичные методы для белков могут разделять их в зависимости от размера или заряда. В обоих случаях гель, через который мигрируют молекулы, готовится с использованием буферного раствора, химического вещества, которое действует для стабилизации рН. Крышка выполняет несколько жизненно важных ролей в электрофорезе.
ток
Гель для электрофореза работает путем подачи электрического тока на погруженную гелевую пластину в буфере. Молекулы ДНК заряжены отрицательно, а белки можно заряжать отрицательно, сначала денатурировав их, а затем обработав их додецилсульфатом натрия (SDS). Белки или молекулы ДНК мигрируют от отрицательно заряженного катода к положительно заряженному аноду. Вода, однако, является довольно слабым проводником тока - она эффективно проводит ток только тогда, когда растворяет в ней вещества, когда заряженные ионы движутся в электрическом поле. Буферный раствор имеет более высокую концентрацию ионов (более высокую ионную силу), поэтому он может нести гораздо больший ток, чем чистая вода.
Изменение PH
PH измеряет концентрацию иона водорода. Изменение рН может изменить суммарный заряд молекул, таких как белок или ДНК, вызывая более медленную (или более быструю) миграцию. Это потому, что эти молекулы имеют основные части, которые принимают ионы водорода (протоны) и много кислотных частей, которые могут пожертвовать протоны. Когда кислота отдает протон, он становится отрицательно заряженным; наоборот, когда база принимает протон, она заряжается положительно. По мере увеличения концентрации ионов водорода в растворе белки и ДНК становятся менее заряженными (или более положительно заряженными). РН, при котором молекула, как и белок, не имеет заряда, называется изоэлектрической точкой. Буферы стабилизируют рН в геле на уровне, при котором ДНК будет заряжена отрицательно и будет мигрировать по желанию.
Укладочный гель
Буферы играют еще более сложную роль в электрофорезе, называемом SDS-PAGE, или электрофорезе в додецилсульфате натрия в полиакриламидном геле. Это один из самых распространенных методов анализа белка. Они денатурируются термической обработкой и затем покрываются додецилсульфатом натрия, и только затем добавляются в гель, который обычно проходит вертикально. У геля есть две области: одна из укладок (в верхней части) и одна под ней. Укладочный гель готовят с использованием другого буфера, так что его pH ниже, чем у используемого геля, кроме того, он имеет меньшую ионную силу. Эти два фактора вызывают укладку белка, так что все идет в гель одновременно. Этот эффект помогает обеспечить разделение белков в геле в зависимости от их размера.
ДНК-электрофорез
Двумя наиболее распространенными буферами для электрофореза в геле ДНК являются трис-ацетат ЭДТА и трис-борат ЭДТА, где ЭДТА обозначает этилендиаминтетрауксусную кислоту. Это важно, поскольку он служит хелатором для ионов магния, удаляя их из раствора. Эти ионы являются важными кофакторами для ферментов, называемых ДНК, которые разрушают ДНК, поэтому ЭДТА в буфере действует как дополнительная мера предосторожности для предотвращения любых проблем с ДНК.